E. Hirsch


PI3Kγ: enzima centrale nel controllo dell'infiammazione e della contrattilità.



Le PI3K (FosfoInositide-3-Kinasi) sono un'importante classe di enzimi presenti in quasi tutti i tipi cellulari dove svolgono un ruolo fondamentale in molti processi come il ciclo cellulare, l'accrescimento e la risposta a segnali e stimolazioni esterne. La loro azione come molecole di trasduzione del segnale consiste nella fosforilazione in posizione 3 dei Fosfoinositidi, una classe di fosfolipidi di membrana. Vengono così generati i PIP3 (FosfoInositidi-trifosfati) che sono importanti secondi messaggeri intracellulari. Tra gli enzimi appartenenti alle varie classi di PI3K note, PI3Kγ è coinvolto nella trasduzione di segnali che passano attraverso una classe di recettori molto particolare: i recettori a 7 domini transmembrana accoppiati a proteina-G. A questa famiglia appartengono un gran numero di recettori per le chemochine, molecole coinvolte nella risposta infiammatoria. Grazie alla generazione e all'utilizzo di topi geneticamente modificati in modo da risultare privi di PI3Kγ (topi knock-out), è stato possibile comprendere e chiarire il fondamentale ruolo che questo enzima svolge nel processo di risposta agli stimoli chemotattici nelle cellule del sistema immunitario e in particolare nei macrofagi e nei neutrofili (cellule che esprimono alti livelli di questo enzima). Infatti, i nostri esperimenti hanno dimostrato come PI3Kγ sia determinante per la migrazione direzionale delle cellule leucocitarie verso il sito dell'infiammazione. In assenza di PI3Kγ, macrofagi e neutrofili sono meno capaci di dirigersi verso il sito dell'infiammazione e quindi i farmaci capaci di inibire selettivamente l'attività di questo enzima potrebbero costituire una chiave di volta per la terapia delle patologie autoimmuni ed infiammatorie nonchè nella cura dell'asma.

Utilizzando un topo mutante esprimente una forma di PI3Kγ costitutivamente localizzata a livello della membrana plasmatica cellulare, stiamo cercando di definire ancor più nel dettaglio il sistema con cui PI3Kγ regola la direzionalità della migrazione. Infatti, i primi esperimenti ci hanno mostrato come la presenza dell'enzima in membrana non è un evento sufficiente per attivare costitutivamente la risposta infiammatoria, ma anzi questa forma di PI3Kγ che, in quanto sempre in membrana non viene "naturalmente" localizzata solo lungo il fronte di migrazione, porta le cellule a non sapere più in che direzione muoversi con risultati sull'animale simile a quelli osservati in assenza totale dell'enzima.

I nostri risultati sembrano indicare il PIP3 (ovvero il secondo messaggero di PI3Kγ) come il responsabile della perdita della capacità della cellula di muoversi direzionalmente e attualmente stiamo cercando di determinare con precisione il meccanismo attraverso cui questo enzima è capace di regolare la formazione del fronte di migrazione dal momento in cui il leucocita "sente" lo stimolo chemotattico al momento in cui si muove secondo il gradiente.



Recentemente PI3Kγ è stata trovata anche in altri tipi cellulari e in altri tessuti dell'organismo, per cui si sta cercando di comprendere quale possa essere il ruolo che riveste in questi distretti. Anche in questo caso l'utilizzo di modelli animali geneticamente modificati è stato fondamentale per mettere in luce alcuni aspetti del ruolo fisiopatologico che PI3Kγ ha nel sistema endoteliale, muscolare e cardiaco. Uno dei primi studi condotti a questo proposito sui topi KO ha mostrato che quando PI3Kγ non è presente, gli animali mostrano una alterata funzionalità a livello cardiaco (mentre la struttura del cuore è intatta), in particolare, già in condizioni basali, la capacità contrattile del cuore appare aumentata. Da questo dato, servito come punto di partenza per il nostro studio, abbiamo osservato le differenze nella funzionalità cardiaca tra topi WT e KO per PI3Kγ, nella situazione in cui il cuore viene sottoposto ad un prolungato sovraccarico di lavoro. Tale situazione viene indotta chirurgicamente attraverso la legatura dell'aorta nel tratto tra le giugulari (indicato come TAC=Thoracic Aortic Constriction). Dopo una settimana dall'intervento i cuori degli animali sono stati analizzati dal punto di vista morfologico e funzionale e ciò ha mostrato che mentre il cuore dei topi WT si adatta al sovraccarico di lavoro aumentando la contrattilità del muscolo, nei topi KO, contrariamente a quanto atteso, essa è drasticamente diminuita e il cuore mostra gravi segni di insufficienza cardiaca, oltre che vaste aree di necrosi tessutale. Per comprendere le ragioni di questa marcata differenza, abbiamo utilizzato un terzo modello di topo geneticamente modificato in cui la proteina viene normalmente espressa ma in una forma inattiva (indicato come Kinase Dead, KD). In questo caso, dopo una settimana dalla TAC, i cuori non solo mantengono la capacità di adattarsi aumentando la capacità contrattile come avviene nei WT, ma sembrano addirittura protetti dallo sviluppo dell'ipertrofia, un processo che, se prolungato nel tempo, può degenerare a sua volta in insufficienza cardiaca. Ci siamo quindi occupati di capire le ragioni di queste differenze fra i tre diversi modelli, analizzando diverse vie di segnalazione intracellulare (Akt/PKB, MAP kinase, cAMP), e siamo giunti alla conclusione che la spiegazione di quanto osservato fenotipicamente risiede nei livelli di cAMP (noto per essere il principale controllore della contrattilità cardiaca) che solo nei cuori KO risulta aumentato rispetto ai WT, non solo in condizioni basali, ma soprattutto, e molto più nettamente, dopo l'induzione del sovraccarico pressorio. Questi risultati ci hanno spinti a cercare di capire in che modo PI3Kγ potesse influenzare i livelli cardiaci di cAMP, abbiamo così scoperto che a questo enzima è associata una particolare isoforma di fosfodiesterasi (PDE), la PDE3B, la cui attività viene modulata in modo specifico dall'interazione con PI3Kγ, in modo indipendente dall'attività chinasica di quest'ultima.



Le patologie cardiovascolari conducono ad un graduale deterioramento della funzionalità contrattile del cuore, dovuto ad un progressivo rimodellamento della struttura cardiaca stessa. Questo processo è definito scompenso cardiaco. I meccanismi alla base dello scompenso sono tuttora sconosciuti, coinvolgendo non soltanto cellule di origine cardiaca (cardiomiociti o fibroblasti) ma anche cellule del sistema infiammatorio, entrambi sistemi in cui PI3Kγ svolge ruoli fondamentali. Abbiamo pertanto investigato il ruolo di PI3Kγ in distretti specifici (sistema immunitario o miocardio) tramite il modello delle Irradiamento/Trapianto di midollo. Partendo da topi WT o PI3Kγ KD, abbiamo depletato il loro sistema immunitario mediante irradiamento e trapiantato tali animali con cellule del midollo osseo di animali di genotipo opposto. Abbiamo così ottenuto animali modello in cui la PI3Kγ inattiva fosse presente esclusivamente nel sistema immunitario (KD→WT) ovvero nel miocardio (WT→KD). Utilizzando il modello della TAC, abbiamo dimostrato come la fibrosi cardiaca insorgente pochi giorni dal danno sia competamente dipendente dalle cellule del sistema immunitario che infiltrano il miocardio stressato.





Sul lungo termine l'inibizione a livello del miocardio risulta comunque vantaggiosa perchè riduce la dilatazione del ventricolo. Pertanto sia l'inibizione della PI3Kγ nel sistema immunitario che nel miocardio hanno singolarmente effetti positivi nel prevenire l'insorgenza dello scompenso cardiaco. Sul lungo termine l'inibizione a livello del miocardio risulta comunque vantaggiosa perchè riduce la dilatazione del ventricolo. Pertanto sia l'inibizione della PI3Kγ nel sistema immunitario che nel miocardio hanno singolarmente effetti positivi nel prevenire l'insorgenza dello scompenso cardiaco.



Nostro obiettivo è ora determinare i meccanismi alla base del funzionamento della PI3Kγ nel miocardio e la sua regolazione, per poter determinare se l'inibizione dell'enzima possa essere una strategia applicabile non solo nella prevenzione ma anche nella terapia dello scompenso cardiaco.

Il gruppo di ricerca è formato da:



Sede dei Laboratori: Centro di Biotecnologie Molecolari, via Nizza 52, Università di Torino

Email: emilio.hirsch@unito.it

Pubblicazioni principali.

Hirsch E., Iglesias A., Potocnik AJ., Hartmann U., Fässler R. Impaired migration but not differentiation of haemopoietic stem cells in the absence of ?1 integrins. Nature. 380, 171-175. (1996).

Hirsch E., Katanaev V. L., Garlanda C., Azzolino O., Pirola L., Silengo L., Sozzani S., Mantovani A., Altruda F., Wymann M.P. Central Role for G Protein Coupled Phosphoinositide 3-Kinaseγ in Inflammation. Science. 287 : 1049-1051 (2000).

Barbier M., Attoub S., Calvez R., Laffargue M., Mareel M., Altruda F., Christian G., Hirsch E., Wymann M.P. Tumour biology. Weakening link to colorectal cancer? Nature. 413 : 796 (2001).

Crackower M.A., Oudit G.Y., Kozieradzki I., Sarao R., Sun H., Sasaki T., Hirsch E., Suzuki A., Shioi T., Irie-Sasaki J., Sah R., Cheng H.M., Rybin V.O., Lembo G., Fratta L., Oliveira-dos-Santos A.J., Benovic J.L., C. Kahn R., Izumo S., Steinberg S.F., Wymann M.P., Backx P.H., Penninger J.M. Regulation of myocardial contractility and cell size by distinct PI3K-PTEN signaling pathways. Cell. 110 : 737-749 (2002).

Garlanda C.*, Hirsch E.*, Bozza S., Antonietta Salustri A., De Acetis M., Nota R., Alessia Maccagno, Riva F., Bottazzi B., Peri G., Doni A., Vago L., Botto M., De Santis R., Paolo Carminati, Siracusa G., Altruda F., Vecchi A., Romani L., Mantovani A. * Authors contributed equally to the work. Non-redundant role of the long pentraxin PTX3 in anti-fungal innate immune response Nature. 420 : 182-186 (2002).

Brancaccio M., Fratta L., Notte A, Hirsch E., Poulet R., Guazzone S., De Acetis M., Vecchione C., Marino G., Altruda F., Silengo L., Tarone G., Lembo G. Melusin, a muscle-specific integrin beta(1)-interacting protein, is required to prevent cardiac failure in response to chronic pressure overload. Nature Medicine. 9 : 68-75 (2003).

Patrucco E., Notte A., Barberis L., Selvetella G., Maffei A., Brancaccio M., Marengo S., Russo G., Azzolino O., Rybalkin S., Silengo L., Altruda F., Wetzker R., Wymann M., Lembo G., Hirsch E. PI3Kγ modulates the cardiac response to chronic pressure overload by distinct kinase-dependent and independent effects. Cell. 118 : 375-387 (2004).